当Sanger及其同事建立第一个DNA链终止延伸法事,只有一种合适的DNA聚合酶可用 ,即大肠杆菌DNA 聚合酶I Klenow片段.它具有在模板存在时聚合dNTP的活性,但缺乏完整聚合酶I的5’-3’外切酶活性.虽然Klenow片段已广泛用于DNA测序,但很显然,这个酶作为测序反应催化酶并不是很理想,他持续合成的能力不强,不能复制富含二级结构的模板区段；以ddNTP为第五的能力远比以dNTP为低；易受DNA制备时经常产生的污染物的影响,并且只对单链模板有效.由于这些不利因素,在大规模测序反应中不再依赖Klenow片段也就不足为奇了.现在由于使用了热稳定DNA聚合酶和修饰版的T7噬菌体DNA聚合酶,大规模测序速度得以显著提高.
    然而Klenow片段对易获得单链DNA模板,并且不须阅读长片段序列的许多小规模测序反应还是非常有用的.包括突变的鉴定、结构的确证和末端缺失的检测.Klenow片段还有一小部分中忠实的、但年龄较大的支持者,他们相信这个酶能测定用其他DNA聚合酶很难测出的克隆DNA片段.其中的原因还不清楚,但可能的因素有对模板的要求上的差异及对耳机结构的敏感性不同.
    Klenow片段测定单链DNA模板序列效果很好,一般可读出300-400个碱基.用于变性后的双链DNA模板就不那么理想了.由于有很多更好的替代没,就没必要用Klenow片段去测变性质粒DNA的序列了.
    下面是来自Sanger等的方案,阐述了用Klenow片段进行单链DNA模板的测序.
材料：
    缓冲液和溶液：
    d ATP（0.2mmol/L）
    去离子水
    EDTA（10 mmol/L,PH8.0）
    延伸/终止混合液和示踪混合液
    甲酰胺上样缓冲液
    TM缓冲液：
   100 mmol/L Tris-HCl(PH 8.5)
   50mmol/L MgCl2
   Tris-HCl.(1mmol/L, PH 8.5)
   酶和缓冲液：
   大肠杆菌DNA聚合酶I Klenow片段（5u/ul）
   每一套四种双脱氧测序反应大约需要2.5单位酶.Klenow片段通常保存在含50%甘油的缓冲液中.测序反应中过量使用酶会导致测序凝胶畸变,因为甘油与制备凝胶和凝胶电泳的标准缓冲液TBE中的硼酸盐粒子相互作用.
   核酸和寡聚核苷酸：
   dNTP和ddNTP ,d NTP(1 mmol/L)和ddNTP(5 mmol/L)储液
   寡核苷酸引物：
   浓度约为0.5pmol/ul(约3.3ng/ul),溶于水中
   单链DNA模板：
   浓度约为0.02pmol/ul,相当于约0.15ug/ul的M13噬菌体单链DNA.
   小规模制备M13噬菌体重组子单链DNA的浓度一般在0.05到0.5ug/ml范围内.这取决于特定噬菌体的生长速度.在正常的粗需反应条件下,模板DNA是过量的.因而每次测序反应中的模板量上的微小变化并不影响测序结果的质量.
   放射性化合物：
   [α-35S]d ATP（1000Ci/mmol,10mCi/ml)或
   [α-33P]d ATP(3000Ci/mmol,10mCi/ml)或
   [α-32P]d ATP(3000Ci/mmol,10mCi/ml)
   5’ 32P标记的寡核苷酸引物：
   若不用放射性标记的[32P] d ATP作为内标记,也可以用5’端以32P标记的寡核苷酸引物进行测序反应.此时可用2ul（约5*105cpm；约0.5ng）放射性标记引物和2ul水代替反应中的未标记引物和[32P] d ATP（步骤4）,其他步骤相同.一般用多核苷酸激酶催化ATP的[γ-32P]转移至寡核苷酸5’末端.
   离心机和转头：
   离心转头或用于0.5ml微量离心管的衔接头,以及甩平式转头的微量滴定板架（如Sorvall公司产品）,聚苯乙醇泡沫或橡胶衬垫.
   专用设备：
   微量离心管（0.5ml）或微量滴定板（柔韧,耐热,每孔容量约为300ul的U型底96孔板）.


   方法：
   1、  在0.5ml微量离心管或微量滴定板孔中加入：
   单链模板DNA(0.1ug/ul)               5ul
   寡核苷酸引物（1ug/ml,约160pmol/ml） 4ul
   TM缓冲液                            1ul
   2、  封闭试管的顶端或密封微量滴定板,在55℃温育反应混合液5-10min,是寡聚核苷酸引物与DNA模板退火.
   若有必要,退火的模板和引物可在-20℃下保藏几个月.
   3、  用字母C、T、A、G标记四个微量心管或96孔U型微量滴定板上四个毗连的小孔；然后在每个小管中加入4ul相应的ddNTP延伸/终止混合液（例如在标记C的微量离心管或微量滴定板孔中加入4ul ddCTP混合液,在标记T的微量离心管或微量滴定板孔中加入4ul ddTTP混合液等）.
   4、  把退火后的引物模板溶液放在冰上并加入：
   [α-35S]d ATP或[α-33P]d ATP或[α-32P]d ATP         1ul
   Klenow酶（约2.5单位）                               1ul
   0.1mmol/L dATP（如使用[α-33P]或[α-32P]）          1ul
   或  
   水（如使用[α-35S]d ATP）                           1ul
   Klenow酶应储存在-20℃,不要使其升到室温.酶在冰桶中几小时会丧失活性.
   5、  取步骤4的混合液3ul加到每一个C、T、A、G管的管壁上或微量滴定板孔的边上.不要让放射性标记混合液与ddNTP延伸/终止混合液接触.
   加入的液体应挂在管或孔靠近边缘的壁上.
   6、  把小离心管放入微量离心机内（用合适的转头或是和0.5ml离心管的衔接头,或把它们放入去盖得1.5ml离心管中）,活着吧微量滴定板放入配有合适衔接头的离心机中,以2000r/min转速离心C、T、A、G各管或滴定板几秒钟,混合反应物.开始延伸/终止反应.37℃温育10-12min.
   在室温至37℃温度范围内,Klenow没都能很好的催化延伸/终止反应和失踪反应.
   7、  温育9-11min后,沿每一个C、T、A、G管或孔壁加入1ul的示踪液.总共温育10-12min后,离心2s,使示踪液混入到延伸/终止的反应液中.再在室温下温育10-12min.
   8、  第二次温育9-11min后,沿每一个C、T、A、G管或孔壁加入6ul甲酰胺上样缓冲液.不要让溶液滑入聚合反应液中.温育结束,离心微量管或微量滴定板终止测序反应.
   9、  反应物在-20℃时可最多保存5天,也可以用变性凝胶电泳直接分析.热变性后（100℃,2min）,在冰上快速冷却.取C、T、A和G反应物各3ul加入测序凝胶各孔中.
 疑难解答：
  虽然用Klenow片段进行双脱氧测序一般会比较顺利,但并非绝对完美.例如,为获得最大量的序列信息,又是必须调整链延伸/链终止反应中的ddNTP和dNTP比例.影响测序结果的更严重的问题,需要通过调整模板制备技术,或在链延伸/链终止反应与聚丙烯酰胺凝胶电泳条件下作一些小的改动来解决.重要的第一步是确定这些问题是系统性的（如影响所有的测序反应）,或是与模板特异性有关的.如果在同一天内对不同模板进行测序的结果差异并不十分明显,可通过可靠模板的测序来快速确定问题的所在（例如曾经给出好的测序结果的模板,或商品化试剂盒提供的模板）.当这种类型的问题出现时,可用商品化测序试剂盒提提供的试剂来判断出链延伸/链终止反应众可能存在的缺陷试剂.
  模板问题：
  绝大多数模板出现的问题不外乎下列四种原因之一.
  制剂中存在污染的DNA（通常是细菌染色体的DNA）；
  制剂中有PEG残留物或高浓度的EDTA.；
  在链延伸/链终止反应中,模板DNA浓度偏低；
  缺少引物结合位点.在测定由外切酶Ⅲ消化产生的缺失突变片段的序列时容易发生这类的问题.这种确实有时会延伸到引物结合区域,因而失去了结合引物的能力.这个问题可以通过采用可结合靶DNA更上有序列的引物加以纠正.
  二级结构问题：
  由DNA模板形成的更加高级的二级结构（例如：同聚片段和回文片段）能强烈地阻止测序反应,结果是在四条泳道上都出现一条放射自显影带.这种区域会严重阻碍DNA聚合酶的前进,这在使用Klenow片段时经常发生.一种解决方法是测定DNA的另一条链；；另一种方法是在50-55℃下测序.此外,也可在第七步加入较多的Klenow酶以补充在终止反应中失活的酶,使之能越过链延伸的阻碍.用dNTP代替dGTP可能减少二级结构的问题.如果采用这种方法,就是用锰代替反应缓冲液中的镁以增强Klenow酶利用类似物的能力.最后一种解决方法是,用其他种类的DNA聚合酶测序,如测序酶或热稳定DNA聚合酶.
  如果与模板二级结构相关的问题依然存在,在链延伸/链终止反应中加入0.5ug大场杆菌（如USB）的单链DNA结合蛋白可解决这个难题.如果使用DNA单链结合蛋白,在家甲酰胺上样缓冲液后,要用蛋白酶K（0.1ug/反应）在65℃温育20min.这样处理可是DNA进入测序凝胶,防止形成弥散条带.