以前认为红细胞、粒细胞、淋巴细胞、巨噬细胞等血细胞都属终末分化细胞 , 很难在体外培养生长或仅能短期培养而不能传代 , 近年来由于细胞培养技术的发展 , 已有血细胞培养成功的报道 , 正常血细胞在体外培养生长时间短 , 只有白血病细胞 , 血友病细胞、淋巴瘤细胞可培养成功并建立细胞系 , 但多半为 EB 病毒等致瘤病毒引起的转化细胞 , （ EBNA 检查阳性） , 二甲基亚砜（ DMSO ）处理也可诱导这些细胞分化发生逆转 , 表现为正常细胞 . 所建立的细胞系多半为单核细胞系、 B 淋巴细胞系、 T 淋巴细胞系 , 只在 IL-2 产品问世后 ,T 细胞才可在体外建系、建株 .
     血细胞可从外周血中用梯度液通过离心分层后分离获得 . 也可从脾脏、扁桃体、淋巴结中用机械法切碎过筛分离获得淋巴细胞 , 从腹腔刺激后的冲洗液中可获得大量的单核 - 巨噬细胞 , 从骨髓中可以获得前提血细胞 , 并可长期培养生长 . 加入生长因子或某些物质有利于细胞纯化并促进分化和生长繁殖 , 例如在淋巴细胞中加入 IL-2 （ TCGF ） , 可促进 T 细胞生长 , 建立 T 淋巴细胞系 . 在多发性骨髓瘤细胞（ B 细胞）培养中 , 加 B 细胞生长因子 , 可建立 B 细胞系；加入 IL-6 （或正常淋巴细胞培养 48h 的培养上清中的 IL6 ）可使 B 细胞在体外长期培养 , 建立了 IL-6 依赖的 B9 细胞系 . 在骨髓单个核细胞培养中加入二羟基维生素 D3, 可使单个核细胞分化为成骨细胞及破骨细胞 .
（一）外周血细胞分离：
    外周血中除红细胞外 , 还有粒细胞、单核细胞和淋巴细胞及血小板等 , 通常是分离这些血细胞的重要来源 . 其分离方法有四种：自然沉降法、差异沉降法、氯化铵分离法、 Ficoll 分离法 .
1 、自然沉降法：
     将无菌抗凝血放入试管中 , 在 37 ℃ 水浴中静置 , 自然沉降 1-2h, 可见到红细胞下沉 , 并有明显分层 , 上层血浆中富含有大量的 和淋巴细胞 , 下层主要为红细胞 . 此方法简便但各层中的细胞种类多 , 不纯 . 血浆中虽以粒细胞、淋巴细胞为主 , 但也含有血小板 , 大单核细胞和少量红细胞 . 下层虽以红细胞为主 , 但也有上述各种细胞 , 此法适用于淋巴细胞转化试验 .
2 、差异沉降法：
     用 6% 的右旋糖酐或 3% 的明胶溶液无菌消毒后 , 分装于中试管中 , 由于这些物质能使红细胞形成 “ 串状 ” , 比粒细胞、淋巴细胞沉降速度快 , 因而可使红细胞与白细胞、淋巴细胞分离开 . 其方法如下：用 6% 的右旋糖酐溶液 5-10ml, 经抗凝血 5ml 加入上层中混合后静置于 37 ℃ 水浴中 30-60min, 即可见红细胞下沉 , 上层富含大量粒细胞和淋巴细胞 , 下层为红细胞 , 使两者易于分离开 , 取上层可用于粒细胞、淋巴细胞培养和实验 , 下层可用于红细胞培养和实验 , 经 PBS 洗 3 次后即可加入培养基培养 , 可用于天然白细胞干扰素的诱生和生产 . 此法分离的细胞纯度也不高 .
3 、氯化铵分离法：
     0.83% 氯化铵（ NH4CL ）可使红细胞破裂 , 通常将分离获得的粒细胞 . 淋巴细胞中混有的少量的红细胞用 0.83% 氯化铵进行裂解 , 以排除红细胞的干扰 . 另外 , 此法也适合大量粒细胞、淋巴细胞的分离制备 , 在天然白细胞干扰素诱生和生产中已被广泛应用 . 方法如下：
     将中心血站供应的健康人外周血离心分离白细胞黄层悬液先经 2000r/min 离心 20min, 吸出上清血浆 , 将下层的红细胞、白细胞混合后 , 加入 0.83 氯化铵 , 用量为血细胞悬液液量的 3 倍 , 于 4 ℃ 作用 20min 后离心弃去上清 .
     在沉淀层中再加入新鲜 0.83 氯化铵混匀后于 4 ℃ 作用 20min, 以便彻底清除红细胞 , 离心弃上清 .
     收货下层的细胞用 PBS 洗 3 次后 , 再用含 5% 人 AB 型血清的（含 100U/ml 卡拉霉素）培养基制成悬液 , 调整细胞浓度为（ 8-10 ） x10^9 个 /L, 分瓶加塞在 37 ℃ 普通培养箱中旋转培养（ 12r/h ） .
    混悬细胞时若加入干扰素诱导剂（ NDV-F ）诱导 22h, 收货上清就可生产白细胞干扰素 . 此法分离的细胞纯度更差 .


4 、 Ficoll 分离法：
     采用 Ficoll 和泛影葡胺配制而成的淋巴细胞分离液 , 通过 2000r/min 离心后可使血细胞以不同相对密度分离开 , 如分离淋巴细胞可选用相对密度 1.077 的分离液；若分离血小板可用相对密度 1.090 的分离液 , 若分离骨髓中的单核细胞常用相对密度 1.120 的分离液 , 现以淋巴细胞分离为例 , 方法如下 .
    取中心血站供应的抗凝血细胞或初步分离的白细胞黄层细胞悬液 , 用无钙、镁离子的 PBS 稀释 3-4 倍 .
    将 Ficoll 淋巴细胞分离液事先分装于离心管中 , 使其沉于管底 , 并在 37 ℃ 中预热 .
    用吸管将经稀释的血细胞悬液沿离心管壁缓慢加入 , 不让细胞悬液冲破分层液界面 , 使其悬于分层液上方 .
    以 2000r/min 离心 20min 后 , 不同细胞可依相对密度不同而分布于各位置上 , 由于红细胞在 Ficoll 作用下成串下沉 , 故在离心管中分布在 Ficoll 层下方 , 淋巴细胞分布在 Ficoll 层上方 .
    收集浑浊带分离获得的淋巴细胞 , 用无钙、镁离子的 PBS 洗 3 次后 , 再用培养基洗 1 次后计数 , 分瓶培养 .
    此法分离获得淋巴细胞纯度高 .
    分离液的制备： 9% Ficoll （ 20 ℃ 下相对密度约 1.020 ） 24 份与 33.4% 泛影葡胺（用泛影钠或 Conray400 也可 , 在 20 ℃ 下相对密度约 1.200 ） 10 份混合后 , 将其相对密度调至 1.077 金额可获得淋巴细胞分离液 , 于 121 ℃ 高压蒸汽灭菌 30min, 室温保存备用 . 若配制高相对密度的分离液用加入高浓度泛影葡胺来调整 , 若配制低相对密度的分离液用稀释的 Ficoll 来调整 .
（二）淋巴器官中淋巴细胞的分离：
    从脾脏、淋巴结、扁桃体或胸腺等器官中制备淋巴细胞悬液 , 在免疫学研究中是经常用到的 . 方法如下 .
    无菌取上述淋巴器官 , 若为扁桃体 , 应将扁桃体在剥离外表的结缔组织和血块后 , 在含高浓度抗生素的洗液中 4 ℃ 浸泡 2-4h, 以防污染 .
     将淋巴器官剪成碎块 , 用镊子压挤碎块 , 或在金属丝网上研磨 , 用洗液冲洗 , 或用玻璃匀浆器研磨 , 制成悬液 .
    自然下沉 10min 后 , 吸取上层细胞悬液 , 弃去下层沉淀的组织块 ,1500r/min 离心 , 取沉淀物 , 用无钙、镁离子的 PBS 洗 2 次后 , 混悬于培养基中 , 分瓶培养 .
    用上述分离法所获得的拎包细胞 , 可用于白细胞黏附移动试验、转化试验、细胞毒试验 , 同时可用于细胞因子的诱生和制备 , 或扩增外周血造血细胞、树突细胞、淋巴因子激活杀伤细胞 (LAK 细胞 ) 、 T δ 细胞等 , 供细胞移植用 .
（三）人脐带血细胞分离培养：
     人脐带血来源方便 , 采集容易 , 对母婴均无伤害 . 近年来研究表明 , 脐带血的血浆中富含许多高水平的造血活性物质 , 具有刺激和促进骨髓造血干 / 祖细胞增殖、分化和再植能力的功能 , 是造血生长因子的重要来源 .
     脐带血中富含类似于骨髓的造血干细胞 , 其中 CFU-G 、 BFU-E 、 CFU-GM 近似或高于正常成人骨髓和外周血中的造血干 / 祖细胞 , 比骨髓更原始 , 具有很强的自我复制和再植能力 . 脐带血中还含有类似于骨髓的基质细胞 , 对骨髓造血具有支持作用 , 在体外培养扩增中具有更大的增值能力 , 是造血干细胞的理想来源 , 已被应用于 Fanconi 贫血、某些白血病和恶性肿瘤的治疗 , 并容易获得骨髓造血功能的重建 .
     随着脐带血造血功能研究的不断深入 , 为体外培养和扩增脐带血干 / 祖细胞建立了切实可行的方法 .


     健康产妇于新生儿娩出后立即断脐 , 用含抗凝剂的采血装置无菌采集正常足月顺产儿脐带血 , 一般可采集 50-80ml.
    将脐带血用无钙、镁离子的 PBS 稀释 2-3 倍 , 缓慢沿壁轻轻加入含 Ficoll-Hypque 淋巴细胞分离液的离心管中 , 注意加样时切勿冲破分层界面 ,2500r/min 离心 25min.
    收集单核 - 淋巴细胞层细胞 , 先用 PBS 洗 2 遍 , 再用培养基洗 1 次 , 活细胞计数 , 存活率应大于 90% 以上 .
    将分离获得的脐带血单个核细胞（ MNC ） , 浓度 109 个 /L, 用含 5%AB 型血清（或 10% 脐带血）的 RPMI1640 培养基 , 外加 10mg/ml 干细胞因子（ SCF ）、 10ng/mlIL-6 和 IL-3 、 2U/mlEPO 、 10ng/ml 的 G-CSF 和 GM-CSF, 置于 37 ℃ 、 5%CO2 下进行培养 .
     每周半量换液一次 , 共培养 5 周 .10 天左右可传代培养 , 不断使脐带血中的单个核下拨进行扩增 , 培养 5 周 , 可使单个核细胞数增加 252 倍 , 同时了检测造血干细胞中 CD34+ 细胞的比例 , 经检测 ,CD34+ 细胞增加 250 倍 . 一般脐带血中 MNC 体外扩增 2 周即可满足一个成人造血干细胞移植的需求 .
    若在分离获得的脐带血单个核细胞中 , 用含 20% 小牛血清的 ROMI1640 培养基外加二羟基维生素 D3 、地塞米松、维生素 C 等刺激物 , 培养 1-2 周后 , 可见有贴壁基质细胞的生长形态（呈梭形、多角形） , 说明脐带血中基质细胞可支持造血干细胞生长 .
（四）巨噬细胞分离培养：
    巨噬细胞有多种功能 , 是免疫应答中重要的抗原递呈细胞 , 是研究细胞吞噬、细胞免疫和分子免疫学的重要对象 . 该细胞易获得 , 便于培养 . 人巨噬细胞难以长期生长 , 多用作初代培养 . 目前所建立的无限细胞系大多来自小鼠 , 如 P388D-1 、 J774A-1 、
    RAW309 、 Cr-1 等均以恶性化 , 但仍保留原有形态和吞噬功能 , 易于传代和脱壁分离 .
    巨噬细胞可来源于人胸水、腹水、血和透析液等 , 实验动物多从血液、肺、脾和胸腔、腹腔获取 , 通常预先注入刺激物后再采集 , 以小鼠腹腔取材法最为实用 , 方法如下 . 实验前 3 天向每只小鼠腹腔注入肉汤培养基 1ml.
    引颈杀死小鼠 , 手提尾将全鼠浸入 70% 酒精中浸泡 3-5s.
    置动物于解剖台上 , 用针头固定四肢 , 剪开腹部毛皮 , 双手用镊子撕开皮肤拉向两侧 , 暴露出腹膜 , 切勿撕破腹膜 .
    用 70% 酒精棉球擦洗腹膜后 , 用注射器吸 10mlEagle 液注入腹腔中 , 同时从两侧用手指揉压腹膜壁 , 使液体在腹腔内充分流动 .
    用针头轻轻挑起腹壁 , 将动物微倾向一侧 , 是腹腔中液体集中于针头下吸入针管内 .
    小心拔出头 , 将液体注入离心管中 ,1500r/min 离心 10min 去上清 , 加 10mlEagle MEM 培养基洗 2-3 次后计数 .
    每只小鼠可产生（ 2-3 ） x10^7 个细胞 , 其中 90% 为巨噬细胞 , 以 2.5x109 个 /L 接种培养 .
    为纯化巨噬细胞 , 去除其他白细胞 , 接种数小时后 , 待巨噬细胞预先充分贴壁 , 此时去除原培养基 , 并用 Eagle 液洗瓶壁 1-2 次 , 再加入新 Eagle MEM 培养基 , 置 37 ℃ 、 5%CO2 温箱中培养 .