一、目的：
    酶是生物细胞产生的以蛋白质 为主要成分的生物催化剂.酶催化生物体内各种化学反应有条不紊的高效进行.酶促反应动力学研究各种因素对反应 速度的影响,包括底物浓度、酶浓度、抑制剂的种类和浓度、pH 和温度等.最基本的动力学关系是底物浓度对酶促反应速度的影响.在无抑制剂的最简情况下,米一曼方程正确地描述了这种动力学关系：
                                  
    反应速度v 和底物浓度[S]有一一对应的关系,要深刻认识某种酶,关键是通过实验测定其最大反应速度Vmax 和米氏常数Km.通过对米一曼方程变形,可找到4 种方法,通过作图求得Vmax 和Km.其中比较常用的是Lineweaver-Burk 作图法（双倒数作图法）,其依据的变形方程为：
                                   
    Vmax. 本实验以果实菠萝蛋白酶粗制品为实验材料,先用离子交换柱层析纯化该酶,再通过时间进程曲线、酶活性、蛋白质含量测定,求得Km 值,加深对酶活性、比活蛋白质纯化的认识,掌握酶动力学测定的一般原理和方法.
二、原理：
    果实菠萝蛋白酶是一种植物巯基蛋白酶,单条肽链组成,含有4％的糖组分,4℃下等电点pI 为9.4,分子质量约28 100 .为了缩短提纯时间,防止或减少自身降解,可采用DEAE 一纤维素离子交换层析,使其作为第一个洗脱峰被洗脱下来而得到纯化.
    果实菠萝蛋白酶可将底物酪蛋白水解为能溶于三氯乙酸溶液的小肽,反应一定时间后用三氯乙酸终止酶反应,用滤液中生成的小肽使吸光度的增加值表示酶促反应速度.据此可作出酶促反应的时间进程曲线,确定反应初速度Vo 的范围.粗酶液和纯化酶液的蛋白质含量可用考马斯亮蓝G-250 法测定.据此可计算酶的回收率.
    根据底物浓度和测得的反应速度,通过作图求得Km 值.根据测得的反应速度和蛋白质含量,可以计算出酶的比活、纯化倍数.在本实验中,果实菠萝蛋白酶活力单位定义为：一个酶活力单位是指在该实验条件下 (pH7.2, 35℃ 时,一定底物浓度、反应体积、反应 10min）水解酪蛋白产生的溶于三氯乙酸的小肽在 275nm 的吸光度等于0.01(1ug/ml 酪氨酸在275nm 的吸光度）时所需要的酶量.其比活力定义为：每毫克蛋白所含蛋白酶活力单位的数量.
三、仪器、试剂和材料：
1．仪器
( 1 ) 层析柱（2x20cm )
( 2 ) 自动部分收集器
( 3 ) 恒流泵
( 4 ) 核酸蛋白检测仪
( 5 ) 离心机
( 6 ) 紫外分光光度计
( 7 ) 恒温水浴
( 8 ) 分析天平
( 9 ) 药物天平
( 10 ) 微量进样器（100 ul )
( 11 ) 容量瓶 50ml X2, 100ml X l
( 12 ) 吸管 1ml x5, 2ml x2, 5ml x6, 10ml x2
( 13 ) 漏斗
( 14 ) 具塞刻度试管15ml
( 15 ) 试管
( 16 ) 12 支烧杯
2．试剂
( 1 )0.002mol / L pH6.0 磷酸缓冲液
( 2 )0.02mol / L pH6.0 磷酸缓冲液
( 3 )0.5mol / L HCI
( 4 )0.5mol / L NaOH
(5）蛋白质标准溶液称取10.0mg 牛血清白蛋白,溶于少量蒸馏水,然后用蒸馏水定容至100ml ,为100 ug / ml 的原溶液.
( 6）考马斯亮蓝G-250 试剂称取100mg 考马斯亮蓝G-250,溶于50ml 95％乙醇中,加入85% ( w / v）的磷酸l00ml,最后用蒸馏水定容至l000ml,过滤后即可使用,此溶液在常温下可放置1 个月.
( 7 ) 25mmol / L 磷酸缓冲液（pH) NaH2PO4·2H2O0.109g , Na2HPO4·12H2O0.645g,水溶后定容至100ml.
( 8）酶反应终止液（D）称取9g 三氯乙酸,15g 乙酸钠,19.5ml 冰乙酸,水溶
    后定容至500ml .
( 9 ) 1%酪蛋白（水浴中加热溶解）


四、操作步骤：
1．样品处理：
    称外购或自制的2g 果实菠萝蛋白酶粗品溶于冷的20ml0.002mo1 / L pH6.0 磷酸缓冲液中,置冰箱内15min. 4℃下,27000g 离心20min .上清液在冷的1000ml0.002 mol / LpH6.0 磷酸缓冲液中透析5h（冰箱内）.相同条件下离心,收集上清液,冰箱内保存备用（以后所有纯化操作均在2℃-4℃下进行）.
2．DEAE 一纤维素离子交换层析：
    称取8gDEAE-纤维素,蒸馏水溶胀后用0.5mol / L Na OH 溶液浸泡0.5h,然后用蒸馏水洗至中性.再用0.5mol / L HCI 溶液浸泡0.5h,然后用蒸馏水洗至中性,最后用0.5mol/ L NaOH 溶液浸泡0.5h,再用蒸馏水洗至中性.将处理好的 DEAE 一纤维素用0.02mol /L pH6.0 的磷酸缓冲液流过层析柱,充分平衡,至流出液为pH6.将10ml 菠萝蛋白酶样品液沿柱子的管壁徐徐注入（多余的酶液放回冰箱保存）,待样品全部入床后,用恒流泵
    输入8-10ml0.02mol/L pH6.0 磷酸缓冲液进行洗脱（流速0.5ml/min ) ,用核酸蛋白检测仪（280nm）监测出峰情况,洗脱液用部分收集器收集,合并第1 峰溶液,为纯化的果实菠萝蛋白酶.
3．蛋白酶的浓度测定：
    ( l）制作蛋白质含量浏定的标准曲线取 6 支刻度试管,按下表1 配制0-100ug/ml牛血清白蛋白溶液l ml.
    表：牛血清蛋白标准液的配制

         

    加入5ml 考马斯亮蓝G-250 试剂,盖好塞子,混匀,放置2min 后,用10mm 光径的比色杯,在595nm 下比色,以第1 管作参比,做出标准曲线.
   （ 2）果实菠萝蛋白酶样品中蛋白质浓度的测定：
    将菠萝蛋白酶粗提液和离子交换柱层析纯化后的酶液分别进行适当稀释,然后分别吸取 lml ,并做1-2 个重复,放入具塞刻度试管中,加入5ml 考马斯亮蓝G-250 试剂,充分混匀,放置2min 后以标准曲线第1 管为参比,同样条件下比色,记录吸光度,并通过查标准曲线计算出粗酶液和纯化后酶液的蛋白质含量.
4．反应体系的准备：
    Al （纯化酶液）根据第3 步的纯化酶液的蛋白质含量,取纯化酶1250 ug ,用25mmol/ L pH7.2 的磷酸缓冲液定容至50ml.
    A2（粗酶液）根据第 3 步测得的粗酶液的蛋白质含量,取粗酶 1250 ug,用 25mmol/ L pH7.2 的磷酸缓冲液定容至 50ml .
    B 2％酪蛋白液,用25mmol / L pH7.2 的磷酸缓冲液配制.
    C 6mmol/L EDTA,30mmol/L L-cys ,用 25mmol / L pH7.2 的磷酸缓冲液配制25ml .
    D 见试剂（8）反应终止液.
5．进程曲线的制作：
    取 试管12 支,编号（0 号为空白）.在1-11 管内各加入纯化酶液A1 20ml , B 液3.0ml,C 液1.0ml 后混匀并立即精确计时,1-11 管在35℃恒温下的反应时间分别为3、5、7、10、12、15、20、25、30、40 和50min .当酶促反应进行到上述相应时间时,在相应的试管内加入 5ml D液终止反应.35℃下静置30min,过滤,滤液在紫外分光光度计上275nm比色（0 管为对照,反应前先加等量B、C、D 液,最后加2 .0ml Al 纯酶液,35℃保温30min后过滤,滤液作参比液）.
    以反应时间为横坐标,A275 为纵坐标绘制进程曲线,确定果实菠萝蛋白酶反应初速度的时间范围.


6．酶活性的测定将：
    Al,A2,B , C , D 五种溶液分别在35℃恒温水浴中保温,取8 支15ml 的具塞刻度试管（纯酶及纯酶的对照、粗酶及粗酶的对照各2 个）按下表2 进行操作：
    表2 曲活性测定

                 

    酶反应体系中加入 Al ,A2, B , C 后混匀,在 35℃ 下保温 10min ,然后加入 5mlD 液终止反应, 35℃ 下,静置30min,过滤.实验的对照组,条件与反应组完全相同,
    只是在加入底物（B 液）之前,先加入 D 液,使酶失活.滤液在紫外分光光度计上275nm测定吸光度.
7.Km 值的测定：
    反应系列的底物稀释：取 5m1 2%的酪蛋白液,加入 5ml 25mmol / L pH7.2 的磷酸缓冲液,混匀,从中吸取 5ml ,同样操作（倍比稀释）,分别得到1 % ,0.5 % ,0.25 % ,0.125% ,0.0625 % ,0.0312%的溶液.
    另取 6 支15ml 具塞刻度试管,分别吸取 2ml Al 液,3ml 上面配制的倍比稀释酪蛋白底物及 lmlC 液,混匀,35℃ 保温10min .然后加入 5ml D 液终止反应, 35℃ 下静置30min ,过滤后在275nm 下测定吸光度.实验对照用纯酶 Al 的对照,测定的结果填入表3.
    表3 K．值测定数据表

                               
五、结果处理：
( 1）将洗脱后测定得到的第一高峰的2-3 管样品合并,然后用0.02mol / L Na2HPO4溶液将酶液pH 调至7.2,并测出混合后的吸光度,置于冰箱内备用.
( 2）在坐标纸上画出洗脱曲线（以洗脱体积为横坐标,吸光度为纵坐标作图）.
( 3）画出测定蛋白质浓度的标准曲线.
( 4）计算出果实菠萝蛋白酶的含量ug／ml.
( 5）计算1250 ug 果实菠萝蛋白酶所应取的酶液毫升数.
( 6）根据以上测定求出粗酶、纯酶的下列值：
    ① 活力单位数； ② 比活力； ③ 回收率； ④ 纯化倍数； ⑤ 纯酶的 Km 值.
六、注意事项：
1．本实验为酶学大实验,为保证顺利完成,请做好预习.
2．反应条件要保持一致,计时要准确.

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