一、花结形成试验分离 E ^＋ 细胞： 
1.制备 AET- 绵羊红细胞：
    1） 在刻度离心管中,用无菌的含 5 ％小牛血清的 Hanks 液洗涤绵羊红细胞 3 次,每次离心 500×g 10 分钟. 
    2） 吸净上清液,测量红细胞比容.轻击试管分散红细胞,加入 4 倍红细胞比容量、新鲜制备的 AET 溶液,混匀.室温中反应 30 分钟. 
    3） 用无菌的含 5 ％小牛血清的 Hanks 液洗涤 AET- 绵羊红细胞 5 次,每次离心 500×g , 10 分钟.用含 10 ％小牛血清的 RPMI-1640 培养液将细胞悬浮至 10 ％（ v/v ）浓度. 10 ％ AET- 绵羊红细胞悬液可在 4℃ 保存三周.
2 ． 用玫瑰花结形成试验分离 E ^＋ 细胞（ Ficoll 分离法）： 
    1 ） 用含 10 ％小牛血清的 RPMI-1640 培养液将单个核细胞悬浮至 10⁷/ml ,加入 1/10~1/20 量的 10 ％ AET- 绵羊红细胞悬液.混合后,室温放置 1 小时.离心 500×g 10 分钟, 4℃ 过夜. 
    2 ） 吸去上清液,用手轻轻旋转离心管,使细胞悬浮,不要用吸管吹打.加入同样培养液至原容量. 
    3 ） 将细胞悬液小心加在半量淋巴细胞分离液上,室温中水平离心 500×g 20 分钟. 
    4 ） 吸弃上层无细胞液体,将细胞培养液和淋巴细胞分离液交界面的细胞和约 85 ％的淋巴细胞分离液吸出,置另一离心管中.交界面的即 E ^－ 细胞,立即向该细胞悬液中加等量洗涤液,离心 500×g 10 分钟,去上清液；再用洗涤液同样洗涤 2 次,除去淋巴细胞分离液,以备进一步分离 B 淋巴细胞和单核细胞. </P< p> 
    5 ） 分离 E ^＋ 细胞：吸出剩余液体,用 10 倍量 Gey’s 液悬浮沉淀细胞 1 ～ 2 分钟,低渗溶解红细胞.立即加入同量两倍浓缩的 PBS ,恢复等渗.离心 500×g 10 分钟,去上清液.再用 RPMI-1640 培养液同样洗涤 2 次.此即 E ^＋ 细胞.用 1 ％台盼蓝染色法测定细胞浓度和细胞活力,用含 10 ％小牛血清的 RPMI-1640 培养液将细胞悬浮至适当浓度. 3 ． 用玫瑰花结形成试验分离 E ^＋ 细胞（ Percoll 分离法）： 
    制备 Percoll 密度梯度： 
    1 ） 将 1 份 10 倍浓缩的 PBS 与 9 份 Percoll 混合,得到等渗的 Percoll 溶液,比重应是 1.127 . 
    2 ） 稀释液（含 25mmol/L Hepes, 10% 小牛血清的 RPMI-1640 培养液）的比重约 1.008 左右.按下式配制不同比重的 Percoll 溶液： ％ Percoll ＝（所需比重－稀释液比重） / （等渗 Percoll 溶液比重－稀释液比重） ×100 
    分离 E ^＋ 细胞： 
    1 ） 取 10ml 5×10⁶/ml 的单个核细胞置离心管中,加 2.5ml 10 ％ AET- 绵羊红细胞和 1ml 小牛血清,混合后, 20℃ 离心 200×g 15 分钟,确定没有悬浮的红细胞,冰浴 60 分钟或过夜. 
    2 ） 轻轻旋转离心管,使细胞悬浮.注意不要用吸管吹打,吹打会打散一些玫瑰花结.将细胞悬液小心加在 7 ～ 8ml Percoll 溶液上,室温中水平离心 500×g 20 分钟. </P< p> 
    3 ） 吸弃上层无细胞液体,将交界面的细胞和约 85 ％的 Percoll 溶液吸出,置另一离心管中.此即 E ^－ 细胞,应立即用 RPMI-1640 培养液洗去 Percoll . 
    4 ） 收集 E ^＋ 细胞：尽量吸弃红细胞上的 Percoll 溶液,用 5ml Gey’s 液悬浮细胞 1 ～ 2 分钟,溶解红细胞.立即将加入同量两倍浓缩的 PBS ,恢复等渗,离心 500×g 10 分钟,去上清液.再用 RPMI-1640 培养液同样洗涤 2 此. 
    5 ） 分别用 RPMI-1640 培养液悬浮 E ^＋ 和 E ^－ 细胞,计数细胞.用荧光标记的抗体测定制剂中的 B 细胞、 T 细胞和单核细胞百分比.
二、用尼龙毛分析 T 细胞： 
    尼龙毛柱的制备（注意无菌操作）： 
    1 ． 取直径 3D ,长度约 10cm 的尼龙毛,用 0.2mol/L HCl 浸泡处理过夜.用双蒸水洗净 HCl ,置 37℃ 烘干备用. 
    2 ． 称取 50mg 尼龙毛,均匀分散后置 Hanks 液中浸泡.取 1ml 注射器,出口接塑料管并夹住.将尼龙毛均匀填塞入注射器中,排净空气,柱高约 5 ～ 6cm .此柱可分离约 2×10⁷ 细胞.将柱置－ 20℃ 可保存 2 ～ 3 个月. 
    分离细胞： 
    1 ． 取 PBMC ,用含 10 ％小牛血清的 RPMI-1640 培养液将细胞配成 2×10⁷/0.5ml . 
    2 ． 融化冻存的尼龙毛柱,以每分钟 5 ～ 7 滴的速度放出 Hanks 液.用 5ml 预温至 37℃ 的细胞培养液洗涤尼龙毛柱.将 0.5ml 上述 PBMC 悬液加入尼龙毛柱中,待细胞悬液全部进入尼龙毛柱后,立即加 0.2ml 细胞培养液,夹住塑料管. </P< p> 
    3 ． 在 37℃ 5 ％ CO₂ 饱和水汽二氧化碳培养箱中培养 1 小时,使细胞与尼龙毛充分粘附.用 5ml 预温至 37℃ 的细胞培养液洗脱尼龙毛柱.洗脱液中含有纯的 T 细胞. 1000×g 离心洗脱液 10 分钟,去上清液.再用细胞培养液洗涤细胞 1 次.计数细胞,用细胞培养液将细胞配成适当浓度. 
三 、用免疫磁珠法分离 T 细胞： 
    将特异性抗 T 细胞单克隆抗体与磁性小珠形成免疫磁珠（ immunomangnetic beads ）,用这种免疫磁珠从 PBMC 中结合 T 细胞.在磁场中,结合 T 细胞的免疫磁珠固定了,未结合的 B 细胞和其它细胞被洗脱下来.再从免疫磁珠上洗脱 T 细胞.