目的要求：
1、学习人体细胞离体培养的方法.
2、掌握制作人染色体标本的方法.
3、观察人类染色体的形态和染色体数目.
实验原理：
    正常情况下人的外周血中很少有分裂相细胞,只有在异常的情况下才能出现.上个世纪60年代Moorhead等人建立了人体外周血白细胞培养技术,在医学,病毒学,药理学,遗传学得到广泛应用.目前,经过实验技术的改进,仅用0.3～0.5 mL全血就能做一次实验.
外周血液中的小淋巴细胞几乎都处于Gl期或G0期,PHA(植物血球凝集素)能有效地促进小淋巴细胞转化成为淋巴母细胞而进入有丝分裂.将细胞在体外培养 3天之后,经过用秋水仙素处理,低渗,固定和离心等操作之后,即可制成人类染色体标本玻片.通过显微镜可以对人的染色体形态和染色体数目进行观察和分析. 结合临床医学上的病例还能进行染色体畸变遗传病的鉴定.
试剂和器材：
1、材料
    人的肘静脉外周血.
2、试剂
    M199或RPMI l640培养液,胎牛血清,肝素,PHA,青霉素,链霉索,5%NaHCO3,碘酒,75%乙醇,秋水仙素,生理盐水,甲醇,冰乙敢,石碳酸品红,KCl低渗液等.
3、器材
    恒温培养箱,电冰箱,高压灭菌锅,离心机,真空泵,分析天平,显微镜,超净工作台,注射器,离心管,培养瓶,试管架,量桶,烧杯,酒精灯,抽滤瓶,G6型号细菌过滤漏斗.
操作方法：
1、药品器皿的无菌处理
    (1) 实验用的所有器皿,器具都必须按规定洗净,高压灭菌处理备用.
    (2) 实验用全部药品都要经高压灭菌或过滤除菌处理.具有生物活性的药品要经G6型号细菌过滤漏斗抽滤除菌,其它药品可经过高压灭菌.
2、各种药品及培养基的配制
    (1) M199基础培养基的配制:称取M199 培养粉9.8g溶于1000 mL双蒸水中,经G6型号细菌过滤漏斗抽滤后备用.使用前最好做热源培养以确保实验顺利进行.
    (2) 5% NaHCO3的配制:称取5g NaHCO3,溶于100mL蒸馏水中,高压灭菌备用.
    (3) 生理盐水的配制:称取0.85g NaCl 溶于l00mL蒸馏水中高压灭菌备用.
    (4) PHA(植物血球凝集素)的配制 称取PHA 50mg配制成浓度为lmg/mL (生理盐水配制)的溶液.由于PHA使用量较少,配制时使用注射器式无菌过滤器,以减少药品损失.
    (5) 肝素溶液的配制:用生理盐水按效价单位配成500单位/mL,高压灭菌后备用.
    (6) 双抗溶液的配制:将青,链霉素用生理盐水按效价单位配成l0万单位/mL,配制过程要求使用注射器式无菌过滤器.
    (7) 秋水仙素溶液的配制:用生理盐水配制成浓度为40微克/mL) 秋水仙素溶液,使用注射器式无菌过滤器进行除菌操作.
    (8) 低渗液溶液的配制:称取5.59g KCl溶于1,000mL双蒸馏水中,配制成溶液浓度为0.075 M 的低渗液溶液.
    (9) 细胞培养基的配制:在每个培养瓶中假如M199 基础培养基 4mL,小牛血清l mL,肝素3滴,PHA 0.3 mL, 加入双抗至最终浓度为 100单位/mL,NaHCO3调pH至7. 2～7. 4.
3、接种全血
    用无菌注射器从肘静脉抽取适量人的外周血,应由专业护士操作.在无菌条件下,向每瓶培养液内加入全血0.3mL即可.
4、血细胞培养
    将细胞培养瓶放在37℃±0.5的恒温培养箱中培养,每天至少摇动培养瓶一次,以保证培养液通气.
5、秋水仙素处理
    细胞培养至68h,向培养瓶中注入秋水仙素0.05～0.1 mL,使最终浓度为0.4～0.8ug/mL,继续培养2~4 h.
6、低渗处理
    细胞培养至72h后,小心地从培养箱中取出培养瓶,轻轻地打开瓶塞,切记不要震荡,避免沉淀的细胞悬浮起来,不利于实验操作.然后用吸管弃去上清液,再加入经37℃培养箱预温的低渗液5mL,盖上瓶塞,轻轻摇动让细胞悬浮起来与低渗液充分混匀.再放回37℃温箱中,保温低渗20min.
7、收集细胞
    把低渗后的细胞悬液全部移入离心管中,以1000转/分 速度离心7min.
8、固定
    离心后弃去上清液,轻轻敲打离心管底部以便让沉淀细胞松动开,再加入新配制的5mL固定液.加固定液时要有冲力,靠冲力把细胞冲散,以防细胞固定成团块.室温下固定15min以后,再离心.
9、重复固定
    去掉清液后,再重复做8的过程.
10、滴片
    弃掉上清液之后,根据离心管壁回留量与沉淀细胞量的多少,再加入少量(约0.2～0.3 mL)固定液制成细胞悬浮液.然后,将2-4滴细胞悬浮液均匀地滴在冰水预冷的载片上.为了便于细胞分散和破裂,滴片时应使滴管与载玻片之间保持一定距离,大约20-30 cm为宜.最后,空气干燥.
11、染色
    在干燥后的载片上,滴加2滴石炭酸品红.用玻棒将染色液展匀,染色5 min之后,自来水冲洗载片的背面(以防冲走细胞),洗去多余染色液,晾干.
12、显微镜观察
    载片晾干以后,先用低倍镜观察,找到分散好的细胞相后灾转至高倍镜下观察.观察时要使用推进器座标尺记录分散良好的细胞位置,便于重新查找.
13、实验结果
    人的染色体2n=46,其中22对常染色体,一对性染色体.男性是XY,女性是XX.按照染色体个体大小和着丝点位置,人们将46条染色体分为A,B,C,D,E,F和G等 7个组,各组别中染色体的特征参见表1.
表1 人染色体组型及其特征