一、实验目的和内容
    目的:了解自然存在的酵母菌及其形态结构.了解酵母菌产生子囊孢子的条件及其形态.
    内容:1．观察酵母菌个体形态.2．观察酵母菌的假菌丝和繁殖过程.3．观察自然状态的酵母菌.

二、实验材料和用具
    酿酒酵母(Saccharomyes cerevisiae)、热带假丝酵母(Candida tropicalis)斜面菌种.PDA培养基、麦氏(McCLary)培养基(醋酸钠培养基)、0.05%美蓝染色液(以pH6.0的0.02mol/L磷酸缓冲液配制)、碘液、0.04%的中性红染色液%孔雀绿,0.5%沙黄液、95%乙醇;
    显微镜、载玻片、擦镜纸、盖玻片、接种环、V形玻璃棒、放置一个三角形玻璃棒支架的培养皿.

三、操作步骤
1．酵母菌的话体染色观察及死亡率的测定:
(1)以无菌水洗下PDA斜面培养的酿酒酵母菌苔,制成菌悬液.
(2)取0.05%美蓝染色液1滴,置载玻片中央,并用接种环取酵母菌悬液与染色液混匀,染色2～3min,加盖玻片,在高倍镜下观察酵母菌个体形态,区分其母细胞与芽体,区分死细胞(蓝色)与活细胞(不着色).
(3)在一个视野里计数死细胞和活细胞,共计数5～6个视野.酵母菌死亡率一般用百分数来表示,以下式来计算:死亡率=死细胞总数 / 死活细胞总数×100%
2．酵母菌液泡系的活体观察:
    于洁净载玻片中央加一滴中性红染色液,取少许上述酵母菌悬液与之混合,染色5min,加盖玻片在显微镜下观察.细胞无色,液泡呈红色.
3．酵母菌细胞中肝糖粒的观察:
    将1滴碘液置于载玻片中央,接人上述酵母菌悬液,混匀,盖上盖玻片,显微镜观察,细胞内的贮藏物质肝糖颗粒呈深红色.


4．酵母菌子囊孢子的观察:
(1)活化酿酒酵母:将酿酒酵母接种至新鲜的麦芽汁培养基上,置28C培养2～3d,然后再移植2～3次.
(2)转接产孢培养基:将活化的酿酒酵母转接至醋酸钠培养基上,置30℃恒温培养14d.
(3)观察:挑取少许产孢菌苔于载玻片的水滴上,经涂片、热固定后,加数滴孔雀绿,lmin后水洗,加95%乙醇30S,水洗,最后用0.5%沙黄液复染 30S,水洗去染色液,最后用吸水纸吸干.制片干燥后,镜检,子囊孢子呈绿色,子囊为粉红色.注意观察子囊孢子的数目、形状和子囊的形成率.
(4)计算子囊形成的百分率:计数时随机取3个视野,分别计数产子囊孢子的子囊数和不产孢子的细胞,然后按下列公式计算:
子囊形成率（%）=3个视野中形成子囊的总数/3个视野中（形成子囊的总数+不产孢子细胞总数）×100%
5．酵母菌假菌丝的观察:
    取一无菌载玻片浸于溶化的PDA培养基中,取出放在温室培养的支架上,待培养基凝固后,进行酵母菌划线接种,然后将无菌盖玻片盖在接菌线上,28℃培养2～3d后,取出载玻片,擦去载玻片下面的培养基,在显微镜下直接观察.可见到芽殖酵母形成的藕节状假菌丝,裂殖酵母则形成竹节状假菌丝.
6．自然状态下的酵母菌观察:
    取一滴美蓝染色液于载玻片中央,春夏秋季取酱油或淹菜上的白膜,冬季取腌酸菜汤上的白膜,将其置于载玻片染色液中,盖上盖玻片,显微镜下仔细观察酵母菌形态,出芽生殖,假菌丝等.

四、注意事项
1．用于活化酵母菌的麦芽汁培养基要新鲜、表面湿润.
2．在产孢培养基上加大移种量,可提高子囊形成率.
3．通过微加热增加酵母的死亡率,易于观察死亡细胞.
注:酵母菌的简易培养   配2%葡萄糖水(或自糖水),煮沸,装入三角瓶中(液面高度2～2cm ),加HCl调至pH3～5放入几块葡萄皮（或其他糖分较高的果皮）,置5～28℃温箱中培养2～3d,闻到酒香味后,即可取培养液镜检.

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