目的要求
1、学习和掌握植物细胞减数分裂制片方法.
2、了解植物生殖细胞的形成过程及减数分裂过程各期的细胞学特征.

实验原理
    减数分裂是生物在形成配子时的一种特殊的分裂方式.减数分裂是在性母细胞中进行的.减数分裂的结果是使二倍染色体数减为单倍染色体数,以便两性配子结合时恢复形成二倍体生物.减数分裂的特点是性母细胞染色体只复制一次,然而连续进行两次细胞分裂(即减数第一次分裂和减数第二次分裂),结果一个小孢子母细胞形成四个小孢子,每个细胞只含单倍数染色体,使原来细胞中的染色体数目减少一半.因此,将这种细胞分裂称为减数分裂.减数分裂的另一个特点是前期特别长,而且变化复杂,其中包括同源染色体联会,交换与分离等.

试剂和器材
1、材料
    玉米(Zea mays 染色体数目2n=20)
2、试剂
    95%乙醇,冰乙酸,硫酸高铁铵,苏木精.
3、器材
    酒精灯,镊子,解剖针,50mL烧杯,10mL烧杯,载玻片,盖玻片,吸水纸,量筒,显微镜.

操作方法
1、取材
    采集正处于减数分裂时期的玉米雄花,此时雄花序尚未抽出旗叶,约10 cm长左右.用手摸植株的上部(喇叭口下部),有松软弹性感觉,便可将旗叶一起抽出,扒开旗叶,剥离出雄花序.取材的时间一般应在上午8:30～10 :30,下午2 :00～4:00为宜.取材时透过颖片可看到花药,如果发现花药是黄颜色的,说明减数分裂已经结束,取材已晚.
2、固定
    将采集来的玉米雄花序放入新配制的Carnoy固定液(3份95%乙醇 : 1份冰乙酸)中固定一周(中间换二次固定液).
3、保存
    采集玉米雄花是有季节性和时间性的,因此每次要多采集一些,保存起来备用.固定好的材料先用95%乙醇洗3次,然后转入70%乙醇中可长期保存.保存材料时要注意使用封口严密的容器,最好使用广口瓶,避免乙醇挥发.保存材料的乙醇每年要更换两次,以保证乙醇的浓度和材料的质量.
4、花药剥离
    每朵玉米雄性小花中的所有花药几乎都处于同一个减数分裂时期.不同小花花药之间可能处于不同的减数分裂时期.因此,在剥离花药时要尽可能地多剥离一些大小不等的花药,以保证能够在实验中观察到减数分裂各个不同时期的图象.剥离花药时要注意将小花颖片剥离干净,使用的镊子和解剖针不可刺破花药,否则花粉母细胞可能会从伤口处外流,影响实验效果.


5、媒染
    剥离出来的花药放进4%硫酸高铁铵(铁矾)水溶液中进行媒染,媒染的时间需4~24h.媒染的目的是让花药中的花粉母细胞中浸入铁离子,这些铁离子可以和染色液发生反应,增强染色体的染色效果.
6、水洗
    媒染后的花药要经彻底水洗,洗净花药表面的铁离子,否则花药表面的铁离子会与染色液反应发生沉淀,影响染色效果.为了水洗彻底,可用尼龙网做一个小口袋,把花药装入口袋里,把口袋固定在水龙头上,流水冲洗5～10min.
7、染色
    将洗净的花药放入0. 5%的苏木精染色液中染色4~24h.为了增强染色效果,可以在25～30℃的温箱里进行染色.若染色时间不足,染色液就很难通过花药壁细胞而进入花粉母细胞中,影响观察效果.
8、水洗
    染色后的花药还须清水冲洗,主要是洗净花药表面的染料.
9、压片
    用解剖针和镊子截取1/2枚花药置于载玻片上,然后滴上一滴45%冰乙酸,并在酒精灯上加热3～5秒钟,注意切不可将冰乙酸加热至沸腾.45%冰乙酸的作用是软化花药壁细胞,使花药壁破裂.另一个作用是使细胞质褪色,起到细胞质与染色体分色的作用.如果加热时间过长,也会把染色体上的颜色全部褪掉.因此,45%冰乙酸也是一种褪色剂.
    材料加热之后,盖上盖片,用吸水纸折叠二层覆盖在盖片之上,用以吸收多余的醋酸,然后,在盖有花药的部位用镊子垂直轻轻敲打,使花药内的花粉母细胞扩散出来,肉眼观察到花药周边有很多云雾状细小颗粒即可.最后,在材料部位用大拇指用力垂直按压,将载片盖片之间压实.
10、镜检
    显微镜下的细胞群中既有花粉母细胞,也有花药壁细胞.而且花药壁细胞中的绒毡层细胞也在进行有丝分裂.因此,在观察时要首先区分花粉母细胞和花药壁细胞.花粉母细胞呈圆形,个体较大;花药壁细胞是长方形,个体较小.一个花粉母细胞可相当于4～5个花药壁细胞的体积.另外,多核细胞是绒毡层细胞.


实验观察结果
    由于同一枚花药中花粉母细胞减数分裂具有同步分裂这一特点,所以在每枚花药中一般只能看到减数分裂中的一个期.减数第一次分裂时间相对较长,且复杂,前期I中就有五个期:
    细线期：染色体呈非常细长的线状交织成网,好似毛线团状.与其紧密相连的是一个看似十分圆滑的原球体,即核仁.此时,虽然染色体都经过了复制后,都含有二个染色单体,但是在显微镜下仍看不到这种结构.
    偶线期：染色体进一步螺旋化进入偶线期.这时同源染色体之间开始准确地识别,配对,这一过程称为同源染色体的联会.这时在显微镜下看到个别染色体的某一点或端部具有双重结构或染色体配对的双股结构.
    粗线期：染色体进一步螺旋化,缩短变粗.由于同源染色体的联会,玉米的染色体数目由原来的20条染色体变成10个二价体.联会也为非姊妹染色体之间交换提供了条件,通过交换可发生遗传物质的相互转移和基因重组.另外,在玉米的某些染色体上存在着若干个深染的颗粒结构,这些颗粒叫染色体结,是玉米粗线期的特有特征.
    双线期：进入双线期以后,联会的同源染色体开始分离.由于配对的二价体在长轴上有一点或几点结合着,而使二价体没有完全分离.这种结合的部位称为交叉,它代表着同源染色体间可能发生交换的位点.
    终变期：染色体高度浓缩使染色体变得更短更粗.具有交叉的染色体上的交叉位点也随之向染色体的末端移动,使带有中部,亚中部和近端部着丝点的染色体形成了"O"形或"V"字形,这一现象叫做端化.终变期也是检查染色体数目的最好时期之一,这时细胞核内有多少个二价体,说明该生物就有多少对同源染色体.另外,在玉米减数分裂的终变期,每个细胞核内总有一个染色体与核仁紧密相连,这是第6号染色体,也是核仁组织者染色体.
    减数第一次分裂的中期,端化的同源染色体排列在赤道面处.同源染色体的两个着丝点彼此相对分布在赤道面两侧.此时,核仁,核膜也已消失,纺锤体形成.
    进入后期时,二价体的二个同源染色体彼此分开,在纺锤体的作用下,染色体开始向两极移动.由于染色体向两极移动时,是以着丝点为先导的,具有两个染色体比,开始解螺旋.
    末期的染色体由于不断解螺旋而变成了染色质状态.核仁核膜重新出现,形成二个子核,每个子核的染色体数目减半为n,即为单倍染色体数,但每条染色体由两个姊妹染色单体所组成.紧接着是细胞质也分裂,便形成了两个子细胞.但这两个子细胞并不分开,一起进入减数第二次分裂,这两个细胞又叫二分体.
    减数第二次分裂是实质上的一次典型的有丝分裂.通过这次有丝分裂,姊妹染色单体分离,细胞质再次分裂,由原来的二分体(两个细胞)变成了四分体(四个细胞). 四分体中的每一个细胞都含有单倍染色体数.但是每个细胞尚不具有授精能力.它还需要通过植物雄配子体的过程,发育成小孢子,才能产生能够授精的细胞,即成熟的花粉粒.

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