目的要求
    1 掌握动物骨髓细胞染色体制备技术.
    2 学会动物细胞的滴片方法.
    3 观察小白鼠染色体的形态特征和染色体数目.
实验原理
    小鼠骨髓细胞具有旺盛的分裂增繁能力.如果把秋水仙素溶液注射小鼠体内,则可破坏骨髓细胞分裂过程中纺锤体的形成,把分裂细胞阻截在中期.通过对小鼠骨髓细胞的低渗,固定,滴片,染色等处理,可观察到小鼠染色体.这种骨髓染色体制片方法简单,取材容易,不需无菌条件,方便易行.
试剂和器材
    1 材料
    健康小白鼠 (Mus musculus 2n=40),体重约18～20g,雌雄不限.
    2 试剂
    甲醇,冰乙酸,石炭酸品红,秋水仙素,KCl,生理盐水.
    3 器材
    恒温培养箱,普通离心机,显微镜,分析天平,架盘天平,离心管(5～10 mL),吸管注射器(5 mL),100 mL烧杯,载玻片.
操作方法
    1 药品的配制
    (1)0.01%秋水仙素:称10 mg秋水仙素,溶于100 mL生理盐水中.
    (2)低渗溶液:称5.59克KCl溶于1,000 mL蒸馏水中,其浓度为0.075 mL/L.
    (3)生理盐水:8.5g NaCl溶于1,000 mL蒸馏水中,浓度为0.85%.
    2 秋水仙素注射
    解剖前2 h,向小鼠腹腔内注射秋水仙素溶液0.5 mL.秋水仙素的作用是破坏骨髓细胞分裂中纺锤体的形成,积累细胞中期分裂相.
    3 解剖小鼠
    秋水仙素注射2h后,将小鼠脱臼处死,取出股骨胫骨,剔净肉,再用纱布块将剩余的肉拧下来,用剪刀剪去骨两端,把注射器针头插入骨腔中,用生理盐水将骨髓细胞冲入离心管中,要反复冲几次尽可能收集更多的细胞.
    4 离心
    离心管配平以后,以800～1,000 r/min离心7 min收集细胞.

    5 低渗
    离心之后,去掉上清液,轻轻敲打离心管底部,加入5 mL低渗液,让细胞与低渗液充分混匀,达到最佳低渗效果.低渗的目的是为了在滴片时细胞容易破裂,便千染色体散开.低渗需要在37 ℃条件下进行,低渗时间为20 min.低渗之后再离心一次,方法同前.
    6 固定
    离心后去掉上清液.轻轻敲打离心管底部使离心作用粘在一起的细胞松动开,加入固定液时要有冲力,将细胞迅速冲开,以防止把细胞固定成团块.在室温条件下,细胞需固定15min.,固定后还需离心一次.
    7 按照6的方法再进行第二次固定.
    8 制备细胞悬浮液
    第二次固定离心后去掉上清液,加入少量固定液制成细胞悬浮液.细胞悬浮液不能太浓,细胞密度过大,细胞重叠,影响观察.细胞悬浮液的密度也不能太稀,细胞太少,这样会影响观察时速度.
    9 滴片
    把细胞悬浮液滴在预先冰水浴的载片上,每张载片滴2滴细胞悬浮液,分别滴在载片的1/3处和2/3处.滴完之后,用嘴用力吹散细胞.冰水片子的作用是细胞受温差作用容易破裂.为了让细胞破裂,分散得更好,滴片时,滴管与载片之间保持一定距离,让细胞"摔"破.
    10 空气干燥
    滴片之后,一定让片子自然干燥后才能染色,否则细胞和染色体会飘浮在染液面上,水洗时被冲掉,影响实验效果.
    11 染色
    彻底干燥之后的片子可以放置在染色缸内或染色板上染色,也可以把染液直接滴在载片上.由于整个载片表面都有细胞,所以,染色液要铺满载片.染色时每张载片滴二滴染液.然后,用玻棒再铺展均匀.注意,玻棒与载片之间不能有接触和磨擦,玻棒始终浮在染液表面,以保证细胞和染色体的完整性.
    12 水洗
    染色之后,流水冲洗载片背面,让多余的水分从边缘把染料带走.冲洗后,马上把片子再翻过来,将有细胞的一面朝上放置.
    13 显微镜观察结果
    显微镜观察可采用"弓"字形搜寻的观察方法,保证观察时不漏掉每一个细胞.另外,要熟练地使用推进器的座标尺,记录良好细胞分裂相的位置,以便最后比较观察和分析.
小鼠染色体为2n=40,所有染色体全部为端着丝点.秋水仙素的浓度,注射量和作用时间对小鼠染色体形态影响很大.如果秋水仙素浓度高,剂量大时,小鼠染色体短粗,进行组型分析会有一定困难.秋水仙素作用时间长时,小鼠染色体多是晚中期.
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