目的要求
    学习和掌握植物细胞有丝分裂制片技术;观察植物细胞有丝分裂过程中染色体的形态特征及染色体的动态行为变化.

实验原理
    有丝分裂是植物体细胞进行的一种主要分裂方式.有丝分裂的目的是增加细胞的数量而使植物有机体不断生长.在有丝分裂过程中,细胞核内的遗传物质能准确地进行复制,然后能有规律地均匀地分配到两个子细胞中去.植物有丝分裂主要在根尖,节间,茎的生长点,芽及其它分生组织里进行.将生长旺盛的植物分生组织经取材,固定,解离,染色,压片等处理即可以观察到细胞内的有丝分裂图象.如若需要进行染色体计数,则需进行前处理,即取材之后采用物理的或化学的方法,阻止细胞分裂过程中纺锤体的形成,使细胞分裂停止在中期.这时,染色体不排到赤道板上,而是散在整个细胞质中.这十分便于对染色体的形态,数目进行观察.

试剂和器材
1材料
    大蒜(Allium sativum 染色体数目 2n=16)；
    玉米(Zea mays 染色体数目2n=20)；
    洋葱(Allium cepa 染色体数目2n=16)；
    蚕豆(Vicla faba 染色体数目2n=12)；
    等根尖为实验材料.
2试剂
    95%乙醇,冰乙酸,石炭酸品红,l mol/L HCl.
3器材
    恒温培养箱,显微镜,水浴锅,载玻片,盖玻片,单面刀片,镊子,培养皿,量筒,吸水纸.

操作方法
1 生根
    植物根尖是植物的分生组织,取材容易,操作方便.植物根尖细胞分裂旺盛,因此,它是细胞有丝分裂相制备与观察的理想选取部位.大蒜,洋葱易于在水培,沙培,土培条件下生根.采用水培时要注意在暗处培养,以满足根生长条件,使根系生长旺盛.玉米和蚕豆种子可先用温水浸泡1天之后,再转入铺有多层吸水纸或纱布的培养皿中,上面盖双层湿纱布置于24～26℃温箱中培养,每天换水二次.
2 取材
    待根长至l.5~2.0 cm时,将根取下.若实验只需观察细胞有丝分裂的过程和各时期的特征,可将根尖直接放入Carnoy固定液(95%乙醇:冰乙酸=3:1)中固定;如果要观察染色体形态和数目,则必须对根尖进行前处理后才能固定.取材和固定必须要在细胞分裂高峰期进行,即分裂细胞占细胞总数最大值时进行,这样分裂细胞比例大,便于选择和观察.
    不同的植物在不同的环境条件,其细胞分裂高峰的时间是不同的.大蒜和洋葱的细胞分裂高峰期通常是在上午9～11点,下午15~17点左右.
3 前处理
    前处理的方法一般采用低温处理和化学药剂处理.
(1)低温处理：
    将取材的根尖放入盛有蒸馏水的烧杯或其它容器内,放在1～4℃的冰箱或其它低温条件下处理24h.不同的植物对低温的敏感程度不同,效果也不同.对低温较为敏感的植物是小麦.
(2)化学药剂处理：
    常用的药剂有0.05%~0. 1%的秋水仙素水溶液;饱和对二氯苯溶液;0.002～0.004 mo1/L 8—羟基喹啉等.
    秋水仙素溶液对纺锤体的抑制效果最好,一般在室温条件下处理2～4h可达到理想的效果.如果处理时间过长,染色体会变得更短,不利于对染色体结构进行研究.
    对二氯苯和8—羟基喹啉对不同的植物效果也不相同.植物染色体数目多,个体小的适合于使用对二氯苯;而染色体中等长度的更适合于8—羟基喹啉,同时能使缢痕区更为清晰.


4  固定
    固定是指用化学药剂将细胞迅速杀死的过程.固定的目的是为了把细胞生活状态的真实情况保存下来,避免在对细胞操作中使生活状态发生改变.植物常用的固定剂是Carnoy固定剂.Carnoy固定剂是用3份95%的乙醇和1份冰乙酸配制成的.这二种药品都具有迅速穿透细胞致细胞死亡的特点,但是乙醇是脱水剂,可使细胞脱水变形;冰乙酸又是一种膨胀剂,可使细胞膨胀改变生活状态,把这二种药品按照3:l配制使用,既可达到迅速杀死细胞又可保持细胞真实生活状态的目的.
    固定的时间可根据被固定的材料大小而定,根尖组织固定4～24h可达到固定效果.固定时间过长,可去掉细胞中的一些脂肪油滴等,便于染色体观察.但是由于固定时间过长,材料易变脆,变硬,给实验操作带来一定困难.
5 解离
    解离的目的是将分生组织细胞之间的果胶质和纤维素等物质破坏掉,便于在制片过程中细胞容易散开.常用的解离方法有二种:
(1)酸解：
    将l mol/L HCl放在60℃恒温水浴锅中预热,当HCl温度达到60℃时,将根尖放入HCl溶液中.解离的时间要根据材料来确定.大蒜,洋葱是百合科植物,纤维素, 果胶质的含量相对较低,解离时间约为4~5min.如果是禾本科植物的根尖,酸解时间要相对加长些.解离时要注意观察,如果解离时间过长,分生组织会与伸长区脱离,这时分生区已经被解离过软,很难操作,而且染色效果不好.
(2)酶解：
    酶解时根尖的伸长区要去掉,只留下分生区.酶的浓度以果胶酶和纤维素酶分别为2%～3%为宜,等量混合后使用.酶解时温度条件非常重要,温度与解离时间成反比,温度高,解离时间就短,但是温度不得超过45℃,否则酶会失去作用.
6 水洗与低渗
    解离后的材料要用清水或蒸溜水冲洗3～5次;酶解的材料洗后还要在水中浸泡10～15min.水洗的另一个作用是后低渗,对于压片有好处.水洗时一定要洗净,否则会影响染色效果.
7 染色与压片
    取根尖分生组织的1/3左右置于载片上,先用镊子或解剖针将分生组织碾碎,尽量铺开.然后,再滴上石炭酸品红染液,染色5 min左右;醋酸洋红或醋酸地衣红要染15～30 min.为了增强染色效果,可在酒精灯上加热几秒钟后继续染一段时间.压片时先盖上盖片,在没有用力压之前,先用手固定住盖片,用镊子尖在材料部位垂直轻敲几下之后,再用拇指用力按压盖片.
8 镜检
    压好的片子要先放在低倍镜下观察,寻找不同分裂时期的典型细胞分裂相,然后,再转换成高倍镜观察.注意观察细胞核内染色质与染色体结构的特点.选择典型的细胞分裂相绘图.
9 永久装片的制作
    将制作好的片子放在冻片机上或液氮容器中将片子冻透,之后迅速用双面刀片将盖片揭开.空气干燥后,用二甲苯透明,再用中性树胶或加拿大树胶封片.冻片子时至冻透为止,切不可时间过长,否则细胞会冻裂.封片时要注意胶量不宜过多,树胶既能达到盖片的边缘又没有多余是最适量的.

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