摘要 分子信标技术是一种基于荧光共振能量转移现象（FRET）和碱基互补配对原则建立起来的一种分析技术.分子信标作为一种荧光标记的分子探针,具有极强的特 异性和较高的灵敏度,目前已经成为基础医学和生物学的重要研究工具.本文着重介绍了分子信标的基本原理及其应用,并对其近年来的研究进展做以简单介绍.
1 引言
    在基因时代和蛋白质时代,人们迫切需要一种具有高灵敏度和高亲和力的生物分子探针,用以进行定性和定量检测.1996年Tyagi和Kramer首 先建立了分子信标技术,很快这种技术就广泛的应用于医学、生物学、分子生物学、临床医学和化学等诸多领域.分子信标技术具有极高的特异性,而且操作简便、 灵敏度高,特别是它可以进行实时定量检测、甚至可以用于活体分析.在临床诊断、基因检测等领域,分子信标也越来越显示出它的优势.近年来,人们对分子信标 的结构作了诸多改进,发展出很多具有更多特性的新型分子信标.随着分子信标的发展,该技术也必将在更多领域中发挥出它的优势.
2 分子信标的原理
    分子信标是一种荧光标记的寡核苷酸链,一般含有25～35个核苷酸.在结构上,分子信标大体上可以分为三部分：（1）、环状区：一般由15～30个 核苷酸组成,可以与靶分子特异结合；（2）、茎干区：一般由5～8个碱基对组成,在分子信标与靶分子结合过程中可发生可逆性解离.（3）、荧光基团和淬灭 基团：荧光基团一般连接在5ˊ端；淬灭基团一般连接在3ˊ端,常用4-（4-二甲基氨基偶氮苯基）苯甲酸（DABCYL）作为淬灭基团.根据 Foerster理论,中心荧光能量转移效率与两者距离的6次方成反比.所以只有荧光基团与淬灭基团之间达到一定的距离时才会产生荧光.
    自由状态时,分子信标呈发卡式结构,从而荧光基团和淬灭基团相距较近（约7～10nm）.此时发生荧光共振能量转移,使荧光基团发出的荧光被淬灭基 团吸收并以热的形式散发,荧光几乎完全被淬灭,荧光本底极低.当分子信标与靶分子结合时,荧光基团和淬灭基团之间的距离加大,从而,分子信标的荧光几乎 100%恢复.而且所检测到的荧光强度与溶液中靶标量成正比.

3、影响分子信标的主要因素
    分子信标中,荧光基团和淬灭基团之间的距离是影响分子信标的最主要因素.根据Foerster理论,荧光基团与淬灭基团之间的距离直接影响荧光的强度.
    另外,温度也是影响分子信标的一个重要因素.在较低温度下,分子信标才可以保持发卡结构.在较高温度下,分子信标将无法保持其发卡结构,甚至使其伸 展为随机线状,造成荧光基团和淬灭基团分离,从而发出荧光,出现假阳性结果.有文献表明,其熔链温度取决于茎干区的长度、G-C含量和缓冲液的离子强度.
    Bonnet等研究温度对分子信标影响时发现,体系的荧光强度呈现为一个先减弱后增强的过程.就此,Bonnet等做出如下解释：

    在较低温度下,分子信标与靶标结合呈S1状态,发出荧光.随着温度升高,分子信标与靶标分离,分子信标重新恢复为发卡式结构即S2状态,从而荧光强度减弱.温度持续增高,将导致分子信标熔链即S3状态,荧光基团与淬灭基团分离,导致荧光恢复.
    环境pH值也是影响分子信标的一个因素.pH值过高,分子信标的发卡结构可能被破坏,出现假阳性结果.此外,分子信标的纯度,也将对分子信标产生影响.


4、分子信标技术在基础医学中的应用
    分子信标技术最初被用作PCR的荧光探针,它既可以对扩增产物进行定量检测,又可以对扩增过程进行实时的检测.近年来,随着分子信标技术的发展和成 熟,人们不断开拓其应用领域,目前,分子信标不仅可以用于基因的定量、定性检测,还可以用于基因点突变等的分析,将分子信标与PNA-DNA-环技术结 合,使检测双链DNA成为可能.另外,分子信标技术还为研究DNA-蛋白质之间的相互作用提供了一种简单、直接、灵敏、实时、甚至可以用于活体检测的方 法.利用分子信标技术在分析、检测核酸和蛋白质中的优点,分子信标技术还可以作为生物芯片和生物传感器的探针.总之,分子信标技术已经广泛的应用在基础医 学研究中的众多领域.
4.1 实时定量PCR测定靶标浓度
    分子信标技术在其出现之初就被用于实时定量PCR测定靶标浓度.这一技术是基于荧光信号积累实时检测整个PCR进程.它是在常规的PCR的基础上加 入相应的分子信标,在PCR的每一循环过程中,都会发生分子信标与扩增产物结合,从而产生荧光,但这并不影响PCR的整个过程.并且只有能和分子信标结合 的DNA模板得到扩增时才能产生荧光信号.所以荧光强度与特异性扩增产物的量成正比,它是模板被PCR扩增的直接标志.与常规的核酸检测方法相比,分子信 标可以进行闭管操作,有效消除核酸的交叉污染,具有实时、定量、高灵敏度、高特异性等特点.
4.2 用于活体内核酸的动态检测
    通过将分子信标注入活细胞内,使分子信标与特定的模板结合产生荧光.可以通过荧光显微镜实时、动态的检测整个过程.如可以用于细胞内mRNA的动态 检测,以了解其在转录等过程中的变化.但活体内存在大量的酶,其中某些酶可能导致分子信标水解,使其结构破坏产生荧光,出现假阳性结果.PNA分子信标可 以很好的解决这一问题,PNA分子信标可以有效的避免核酶的水解,使荧光强度能准确反映活体内的过程.
4.3 用于双链DNA的检测
    与RNA不同,DNA是双螺旋结构,常规方法难以进行检测.而分子信标技术可用于双链DNA分子的检测.PNA与双链DNA互补链结合时可以取代非 互补链,使其解离成单链,形成P环结构.解离后的DNA双链及可用分子信标技术检测,使分子信标与DNA变性部分结合,从而出现荧光.
4.4 用于蛋白质的检测
    随着基因组学的发展,出现了蛋白质组学,人们越来越发现许多问题要到蛋白质中去寻找答案.这就要求人们能够对蛋白质各方面的性质可以加以检测.此 外,人们把蛋白质和核酸联系起来,研究蛋白质和核酸之间的相互作用,这一课题已成为现代分子生物学的研究热点之一.与传统的蛋白质研究方法（如X单晶衍 射、圆二色谱等技术）相比,分子信标技术具有简单、灵敏的特点,又可以实现实时检测,甚至可以用于活体检测.
2001年,Tan等发表文章阐述了其应用分子信标技术研究蛋白质所取得的结果.他们用分子信标来检测单链结合蛋白,实验发现,分子信标产生的荧 光.所产生的荧光强度较分子信标与核酸结合时产生的荧光强度小,但其强度远远大于分子信标与核酸发生错配时产生的荧光强度.同时他们还发现分子信标不能与 双链结合蛋白结合,产生荧光.
    Nobuko Hamaguchi根据分子信标的原理设计了Aptamer信标,可以直接用来检测蛋白质.这一方法与传统的酶联免疫吸附法测定蛋白质相比,具有简单、灵 敏等优点.但这一方法不能用于检测非特异性ssDNA结合蛋白,而且分子信标的构象受金属离子影响很大,一些金属离子的存在会干扰荧光信号的观测.
4.5 用于基因的检测
    在基因时代,基因的检测方法也取得了飞速发展.近年来,国内外很多科学家尝试用分子信标技术来检测基因,并取得了初步的成果.人们将分子信标技术与毛细管电泳技术相结合,初步实现了基因检测的自动化或半自动化,使大面积、高通量筛选成为可能.


5、分子信标技术在临床医学中的应用
5.1 分子信标技术在癌症诊断中的应用
    2001年宾夕法尼亚大学的B.Chance 教授在美国物理学会上宣布,他和同事合作制得了可以用于癌症诊断的分子信标,并在老鼠体内取得了初步的成功,已准备做临床实验.
    他们首先将分子信标注射到体内,当它与乳腺癌有关的生化酶发生作用时才会打开,否则就保持密封状态.信标打开后就会在体外装置中的光束在近红外处发 生荧光响应,从而探测到信标的信号,由于信标能发射大量的近红外光,所以它可以通过人体.这种方法没有离子辐射且价格便宜,其成本约为几千美元.这种装置 的另一个优点是它的工艺及实施以常用的光盘和单元电话为基础的,从而简便、易行.
5.2 分子信标技术用于SARS的诊断
    2003年SARS病毒在中国内地的出现以及在全球部分国家的肆意和传播,给人类健康提出了严峻的挑战.许多国家的科研人员都在开发快速和精确检测 SARS病毒的方法和技术,诸如RT-PCR、ELISA、免疫荧光法等,并已经在推出相应的检测试剂盒.但是,目前这些检测仍然需要结合临床体征的判 断,这主要是由于这几种方法还存在着一些自身缺陷,比如RT-PCR对SARS检测的灵敏性还不令人满意,即有出现假阴性的倾向,曾报道有出现漏检的情况 发生；使用免疫荧光法和ELISA法的SARS抗体检测也存在敏感性问题；其中免疫荧光法又只能在病人感染病毒10天以后才能检测出抗体,而ELISA则 要在20天以后才能检测出抗体.
    分子信标技术的基本原理应用的是碱基互补配对原则,这就有效的保证了用此技术检测SARS病毒的特异性.此外作为基因水平的检测其灵敏性也较上述方 法高.于上述方法需要再感染几天后才能检出相比,分子信标技术只要体内有SARS病毒的核酸出现即可被检出,从而为临床治疗赢得宝贵的时间,具有较大的临 床应用价值.
5.3 分子信标技术用于乙肝病毒的检测
    Yates等2001年在临床微生物学杂志发表文章,提出了用分子信标技术检测乙肝病毒的方法.该方法定量检测HBV DNA,具有简便、易行、可靠等优点,有很好的应用前景.目前,国外已有成型的试剂盒出售,国内也有类似产品.
6前景与展望
    分子信标技术自其诞生以来,由于它极高的特异性、灵敏度等特点迅速进入生物学、基础医学、临床医学等各个相关领域.人们对分子信标的结构也进行了数 次改进和发展,使之可以在更广的范围内发挥更大的作用.以分子信标技术为基础人们开发出可进行高通量筛选的芯片.如果该技术与纳米技术、激光共聚焦技术等 其他先进技术相结合,也必然会促进分子信标技术的发展.毫无疑问的是分子信标技术有着广阔的应用空间.随着制备技术的发展,设计方法的改进分子信标技术必 将更加完善.
参考文献
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