仪器设备
1、医用微波炉；
2、水浴锅；
3、OLYMPUS BX51荧光显微镜；
4、OLYMPUS DP11数字显微照相机.

FISH试剂
（1）1×PBS：由10×PBS溶液稀释而成,储存于4℃；
（2）20×SSC（pH7.0）；
（3）2×SSC,由20×SSC溶液稀释而成；
（4）25mg/ml蛋白酶K消化液.
（5）变性液(70％甲酰胺+2×SSC,pH7.0)：4ml 20×SSC；8ml蒸馏水；28ml甲酰胺.每次新鲜配制.
（6）杂交后洗涤液： 20×SSC 4ml；蒸馏水16ml；甲酰胺20ml.每次新鲜配制.调节pH前升至室温.

实验步骤
1、脱蜡：
1）二甲苯脱蜡3次,每次5min；
2）100％酒精两次,每次2min；
3）移出酒精,斜置切片,标记末段向下,空气干燥.
2、蛋白酶处理:
1）每个染色缸40ml蛋白酶K消化溶液,配制方法如下：2×SSC 40ml倒人    Facal管,在水浴槽中预热.将消化酶液加入管内,摇动直到酶溶解.
2）37℃水浴槽中预热染色缸和蛋白酶K溶液.37℃孵育20min.
3）×SSC在室温下漂洗切片3次,每次1min.
4）梯度酒精脱水（-20℃预冷）.
3、变性：
1）每一个立式染色缸配制40ml变性溶液；
2）78℃水浴槽中平衡预热混合液染色缸；
3）78℃孵育8min；
4） 即移入-20℃预冷70%酒精的染色缸内2min,再依次移入80%、90%和 100%的-20℃预冷酒精内,每缸2min；
5）空气干燥.

 


4、杂交：
1）准备探针；
2）取一个较大的湿盒,交叉放置切片；
3）滴10μl探针在切片的组织上,加盖玻片；
4）盖上湿盒盖,37℃孵育12h～16h.杂交后的水洗：
5）镊子小心去除盖玻片；
6）43℃预热杂交后水洗溶液40ml水洗切片15min；
7）2×SSC(37℃)洗两次,每次10min；
8）切片放人染色缸的1×PBS内待检测,勿使切片干燥.检测：
9）从1×PBS中取出切片,除去过多的水分,避免标本干燥.把切片放入湿盒内,同时处理4张切片.
10）每张切片使用30μl～60μl罗丹明抗-地高辛抗体或FITC卵白素,室温下孵育20min；
11）去掉塑料盖膜,把切片放入含1×PBS的染色缸.1×PBS室温下洗3次,每次2min.扩增：
12）从1×PBS中取出切片,斜置切片使液体排出；
13）每张切片滴30μl～60μl抗-卵白素抗体,加塑料盖膜,室温孵育20min；
14）去掉塑料盖膜,把切片放人含1×PBS的染色缸.1×PBS室温下洗3次,每次2min；
15）从1×PBS中取出切片,斜置切片使液体排出；
16）每张切片滴30μl～60μl抗-卵白素抗体,加塑料盖膜,室温孵育20min；
17）1×PBS室温下洗3次,每次2min.

5、细胞核染色：
1）张切片加10μl～20μl DAPI,覆盖盖玻片并在室温下孵育2～5ml；
2）尽可能快的在荧光显微镜下观察或封闭盒内保存在-20℃冰箱.切片在染色之后1h内可以在显微镜下观察.

PRINS步骤
1、常规脱蜡浸入0.01mol/LPBS；
2、用0.2mol/L盐酸处理5min；
3、蛋白酶K(25μg/m1)消化37℃ 15min；
4、分别用80％,95％和100％酒精脱水,室温干片；
5、 加PCR混合液25μL(10mmol/L Tris-HCl,50mmol/L KCl,1.5mmol/L MgCl2,各加200μmol/L dATP,dCTP,dGTP,1.5mmol/L dig-11-dUTP l.5μl,引物250ng,Taq DNA聚合酶2U),加盖片；
6、94℃变性5min后置入65℃湿盒中5min；
7、用0.1×SSC液,65℃洗5min；
8、片于65℃ 10s～20s；用4×SSC-0.1％吐温20液42℃洗5min,2次；
9、经Buffer I液洗后滴加20％羊血清封闭30min；
10、加地高辛抗体复合物(1:500)室温下2h；
11、BufferⅢ液洗5min；
12、用BCIP-NBT显色1h～2h,在镜下控制,终止显色；
13、用中性红或核固红衬染,酒精脱水,二甲苯透明,树脂

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