热稳定 DNA 聚合酶除了在大家熟悉的 PCR 反应中应用外,它还可用来代替测序酶或 Klenow 片段进行双脱氧链终止法测序.它在高温下（ 70 ℃ ）进行等温链终止反应的能力可减少测序反应中由于模板 DNA 上引物假结合位点与引物退火错配产生的相关问题,它还可以用于富含二级结构模板的测序.当然也有一些不足, DNA 聚合酶 I 家族的热稳定聚合酶（如 Taq 酶）和 Archaea 编码的热稳定酶（如 Pfu ）催化 ddNTP 在特定位点的掺入速度比 dNTP 掺入速度至少小两个数量级.此外, ddNTP 在特定位点的掺入速度受该区域模板 DNA 序列的影响.使用 Taq DNA 聚合酶作标准测序的研究者有如下经验：在测序凝胶的放射自显影片上条带间的强度不同,从底部到顶部条带逐渐减弱,出现阴影带.
    这些问题可通过使用遗传工程版热稳定 DNA 聚合酶加以减轻.该类酶确实了 5’-3’ 外切酶活性并能高效率地催化 ddNTP 掺入.不过,这些修饰酶相对较贵,最好在需要用等谱带强度以达到阅读长序列的循环测序时使用.当由于引物错配或形成二级结构导致读特殊序列片段时出现模糊不清的结果的情况下,野生型 Taq DNA 聚合酶仍不失为测序酶的一种有效地替代物.
    突变的热稳定酶都迅速取代野生型酶作为双脱氧测序可供选用的 DNA 聚合酶.由于突变热稳定酶在利用 dNTP 和 ddNTP 方面差别较小,这两种脱氧核苷酸在测序反应中的比例必须改变.热稳定 DNA 聚合酶的制造商通常都提供最适合各种酶的标记混合液配方.若没有厂商的有关资料,可用下列标记混合液配方：混合配制含有 150umol/L d NTP 和 1.5umol/L dd NTP 的新鲜 ddNTP 溶液.例如在 ddATP 混合液中,加有 150umol/L 的每一种 dATP 、 dTTP 、 dCTP 和 dGTP （或 7- 脱氧 -dGTP ）和 1.5umol/L 的 ddATP .用 Taq DNA 聚合酶测序操作步骤与用测序酶测序步骤相似：
    使双链 DNA 模板变性 （必要时）,并使引物与其互补序列配对.
    短时的聚合反应在低温下（ 42 ℃ ）,使引物延伸 20-100 个核苷酸.这一部要在聚合酶过量且 4 种 dNTP 浓度有限的条件下进行.在这一反应中,应有一种放射性标记的的 d NTP , 从而使这一段延伸物能在多个位点被放射性标记.在此步预聚合反应中,绝大多数可用的dNTP ,包括放射性标记的dNTP 都应掺入 DNA 中.
    在含有高浓度未标记的 dNTP 和一种未标记的 ddNTP （ ddA 、 ddG 、 ddC 或 ddG ）的 4 个反应中已延伸的标记引物的延伸和终止.延伸 - 终止反应在 70 ℃ 进行.
材料
缓冲液和溶液：
    去离子蒸馏水（冰预冷）；ddNTP,4 种 ddNTP 储液（ 5mmol/L ）；dNTP, 4 种 dNTP 储液（ 5mmol/L ）
甲酰胺加样缓冲液 ：
    10* 标记混合液和 ddNTP 延伸 / 终止混合液
酶和缓冲液 ：
    5* 反应缓冲液 ；200 mmol/L Tris-HCl(PH 8.8) ；25mmol/L MgCl2 ；Taq 酶（ 5u/ul ）或类似的热稳定 DNA 聚合酶 ；
Taq 酶稀释缓冲液 ：
    25 mmol/L Tris-HCl(PH 8.8) ；0.01 mmol/LEDTA(PH8.0) ；0.15% Tween-20 ；0.15% NP-40
核酸和寡核苷酸 ：
    寡核苷酸引物 （浓度约为 1.0pmol/ul( 约 6.6ng/ul), 溶于 TE(ph7.6) 中 ）；（模板 DNA(100 ng/ul), 溶于 TE(ph7.6) 中 ）
放射性化合物 ：
    [α-35S]d ATP （ 1000Ci/mmol,10mCi/ml) 或 [α-33P]d ATP(2000-4000Ci/mmol,10mCi/ml) 或 [α-32P]d ATP(3000Ci/mmol,10mCi/ml)
5’ 32 P 标记的寡核苷酸引物 ：
    若不用放射性标记的 [32P] d ATP 作为内标记,也可以用 5’ 端以 32 P 标记的寡核苷酸引物进行测序反应.此时,可用 1.0-1.5pmol 放射性标记引物和 2ul 水代替反应中的未标记引物 d ATP （步骤 1 ）,其他步骤相同.一般用多核苷酸激酶催化 ATP 的 [γ-32P] 转移至寡核苷酸 5’ 末端.


专用设备：
微量离心管（ 0.5ml ）或微量滴定板（柔韧,耐热,每孔容量为 300ul 的 U 型孔 96 孔板）.
装有多孔加热板的程控热循环仪.
其次可选用 45 ℃ 和 72 ℃ 的水浴.见第 8 步说明.
可加热到 65 ℃ 水浴.
方法
1、 在 0.5ml 微量离心管或微量滴定板孔中加入：
    单链模板 DNA （ 250fmol ） ( 约 100ng/nl) 5.0ul
    寡核苷酸引物（ 0.5pmol ） ( 约 3.3ng/nl) 3.0ul
    5 × 反应缓冲液 2.0ul
2、 在 65 ℃ 温育密封的微量离心管 2min .从水浴中取出离心管,使之在 3-5min 内冷却到室温.
3、 在引物与模板降温时,融化 10* 标记混合液、 ddNTP 延伸 / 终止混合液和放射性标记的 dATP ,溶化后置于冰上.
4、 在每一个彩色标记的 0.5ml 微量离心管或每一个提前标有 C 、 T 、 A 和 G 的微量滴定板孔中加入 4ul 与其相对应的 ddNTP 延伸 / 终止混合液（如标记为 C 的微量离心管和微量滴定板孔加入 4ul ddCTP 混合液,标记为 T 的微量离心管和微量滴定板孔加入 4ul ddTTP 混合液等）,并将微量离心管或微量滴定板置于冰上.
5、 按 1 ： 8 比例稀释足够的热稳定 DNA 聚合酶用于所有模板测序,例如
    Taq DNA 聚合酶（ 5-10u/ul ） 1ul
    Taq 酶稀释缓冲液 7ul
    每一组四种测序反应需要 2ul （ 2u ）稀释酶.酶终浓度应为 1u/ul .稀释后的酶要一直放在冰上贮存.
6 、把下列物质加入到各退火反应管中（上述步骤 2 ）
    10* 标记混合液 2ul
    放射性标记 dATP 0.5ul
    稀释的 DNA 聚合酶（约 1u/ul ） 8ul
    涡旋振荡混匀,然后在 45 ℃ 温育反应 5min
7、 转移 4ul 标记反应液到含有相应的双脱氧终止混合液的 C 、 T 、 A 、 G 各管或微量滴定板各孔中（上述步骤 4 ）,沿微量离心管和微量滴定板孔壁加入.
8、 把小离心管放入微量离心机内（用合适的转头或适合 0.5ml 离心管的衔接头,或把它们放入去盖的 1.5ml 离心管中）,活着吧微量滴定板放入配有合适衔接头的离心机汇总,以 2000r/min 离心 C 、 T 、 A 和 G 各管或滴定板几秒钟,混合反应物. 72 ℃ 温育 5min .
    把小离心管或滴定板放在高效加热块中温育,也可以放在水、油或其他导热效率高的介质中.或放在 72 ℃ 空气温箱中,在这样短的温育过程中达不到 Taq DNA 聚合酶所需的理想温度.
9、 加入 4ul 甲酰胺上样缓冲液终止反应.
10、 这些反应物在 -20 ℃ 时最多可保存 5 天,也可以用变性凝胶电泳直接分析.热变性后（ 100 ℃ , 2min ）,在冰上快速冷却.去 C 、 T 、 A 和 G 反应物各 3ul 加入测序凝胶的各孔中.