1 ．材料和试剂

  1.1 培养液 A ： DMEM 培养液添加 10% 的胎牛血清（ FBS ）.

  1.2 培养液 B ： DMEM 培养液添加 10% 的胎牛血清（ FBS ）和终浓度为 0.7--1μg/ml 的放线菌素 D .

  1.3 L 929 细胞株：鼠结缔组织纤维母细胞,来源于 22 天雄性 C3H 鼠皮下组织.

  1.4 结晶紫染色溶液： 0 . 05% 结晶紫 (50mg 结晶紫加入 20ml 乙醇 , 加蒸馏水定容至 100ml) ,蒸馏水稀释.

  1.5 脱色液：

  （ 1 ）乙二醇独甲醚 50% ,蒸馏水稀释.

  （ 2 ）乙醇 50% ,乙酸 0.01%(V/V) ,蒸馏水稀释.

  1.6 胰酶：消化贴壁 L929 细胞.

  1.7 半效稀释度 TNF 标准品： 1000IU/ml .

2. 实验用具

    超净工作台,细胞培养烘箱,酒精灯,显微镜,细胞计数器,微量移液器,细胞培养板,细胞稀释槽,酶标仪.

3. 操作步骤

3 .1 样板：

    弃 L929 细胞培养瓶中的培养液,加入 800—900μl 胰酶消化细胞,细胞收缩后,弃胰酶,加入 4ml 培养液 A ,吹打细胞,混匀,用细胞计数板在显微镜下计数,并计算所需细胞总数,培养液体积,将消化好未贴壁的细胞重新悬浮于完全培养液 A ,并调整细胞浓度为 10×104/ml 左右并将细胞接种于 96 孔培养板中,每孔 100μl,37°C , 5%CO₂ 培养过夜或 24 小时,待细胞贴满板壁 80% 以上时,方可加样.

3.2 样品处理和稀释：

    将待测样品和标准品用培养液 B 溶解至 1 ml ,（样品为冻干粉状）.如标准品为 1000IU/ml , 10 倍稀释至 100IU/ml 作为起始浓度,样品则根据实际情况都做 10 倍梯度稀释,并以最低浓度定为起始浓度（以上操作均在 24 孔板中操作）.

    从样品和标准品中的起始浓度中取 200μl 加入到 96 孔板 A2-A12 中,其余各孔均加入 150μl 培养液 B ,再从 A2-A12 中各取 50μl ,对 B-H 各排进行逐级四倍梯度稀释 .

3.3 加样：

    标准品和样品经稀释后,吸去已经培养好的细胞培养板中的上清液,每孔依次加样 100μl ,并在边缘未加样的各孔加入 100μl 培养液 B ,消除边缘效应,放入烘箱 37°C , 5%CO2 ,培养过夜.

3 .4 染色和脱色：

    L929 细胞培养过夜后,镜检在半数死亡孔到达 D 或 E 时终止反应,吸取上清,轻轻吹打 2—3 次,除去死细胞,每孔加入染色液 30μl ,静置 5 分钟左右.

    用流水轻轻冲掉染色液,每孔加入 100μl 脱色液脱色,轻轻摇动使脱色完全,然后于酶标仪 570nm 波长下比色,测 O.D. 值 , 并设对照 .

4. 处理数据 ：

    在座标纸上以 570nmO.D. 值 ( 双孔加样测两点值的平均 ) 对稀释倍数做图 , 并以标准品的最低 , 最高 O.D. 之平均值做一平行于 X 轴的直线交各曲线 , 以各相应曲线与该直线交点在 X 轴上读出半效量的稀释度 , 按下式计算效价 :

    TNF 成品活性 (IU/ml)= 标准品效 价× ( 样品预稀释倍数 / 标准品预稀释倍数 ) × ( 标准品半效量稀释度 / 样品相当于标准品半效量的稀释度 )